癌症治疗中，黑磷（BP）展现出作为药物载体和光热剂的潜力，但在癌症治疗中的功能仍有待深入探索。本研究探讨了聚乙二醇功能化黑磷（BP-PEG）纳米片在乳腺癌模型中的免疫调节作用。作者使用包括 4T1 荷瘤BALB/c 小鼠和 MMTV-PyMT 转基因小鼠在内的免疫活性小鼠模型。研究发现 BP-PEG 能显著抑制肿瘤生长和转移，且不直接诱导肿瘤细胞毒性。质谱流式分析表明，BP-PEG 通过募集中性粒细胞重塑肿瘤免疫微环境。中性粒细胞耗竭实验进一步证实，BP-PEG 的抗肿瘤效应依赖于中性粒细胞。常规RNA测序和单细胞 RNA 测序结果显示，BP-PEG 主要被巨噬细胞摄取，进而诱导 IL1A 和 CXCL2 等炎症因子释放，这些因子会增强中性粒细胞的募集和激活，从而放大抗肿瘤免疫应答。最后，共培养实验证实，BP-PEG 确实能增强中性粒细胞和自然杀伤（NK）细胞的抗肿瘤活性。这些发现表明，BP-PEG 是一种能够重编程肿瘤微环境、以增强抗乳腺癌先天免疫的免疫调节制剂。通过激活中性粒细胞介导的抗肿瘤活性，BP-PEG 提供了一种独特的治疗策略，有望提升现有癌症免疫治疗的疗效。

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1. BP-PEG 合成表征及抗肿瘤抗转移活性验证

为提升黑磷（BP）的稳定性，本研究通过超声剥离BP晶体并与聚乙二醇（PEG）偶联，成功合成了聚乙二醇修饰的黑磷（BP-PEG）纳米片。透射电镜和扫描电镜（SEM）结果显示，BP和BP-PEG均呈现典型的二维片状结构，BP-PEG纳米片尺寸多集中在100 nm左右，小于200 nm，有利于体内稳定性和组织靶向性；zeta电位从BP的-27.6 mV变为BP-PEG的-18.1 mV，证实PEG修饰成功，显著提升了材料的胶体稳定性；能量色散X射线光谱（EDS）、红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）和拉曼光谱等进一步验证了BP-PEG的化学组成和结构特征，原子力显微镜（AFM）显示其厚度为10-20 nm，较未修饰BP纳米片略有增加。在免疫活性乳腺癌小鼠模型的抗肿瘤活性评估中，将4T1乳腺癌细胞接种到BALB/c小鼠乳腺脂肪垫构建同源肿瘤模型，当肿瘤体积达到约100 mm³时静脉注射BP-PEG。结果显示，与对照组相比，BP-PEG处理组的肿瘤生长显著受到抑制，肿瘤明显降低，主要器官组织学分析未发现明显毒性。对照实验表明，单独使用PEG对肿瘤生长无显著影响，相同浓度下BP单独处理与BP-PEG的抗肿瘤效果相当，而5 mg/kg剂量的BP-PEG效果弱于10 mg/kg，因此确定10 mg/kg为后续实验的适宜剂量。在更贴近人类乳腺癌进展的MMTV-PyMT转基因小鼠模型中，BP-PEG同样表现出显著的肿瘤生长抑制作用，证实其在模拟人类乳腺癌的模型中具有稳定的抗肿瘤和抗转移作用。

2. BP-PEG 无直接细胞毒性且依赖免疫系统起效

为探究BP-PEG的抗肿瘤机制，作者首先通过荧光标记和流式细胞术对比了肿瘤细胞在体内外对BP-PEG的摄取情况，发现体内肿瘤细胞摄取的BP-PEG量相当于体外4T1细胞在5 μg/mL浓度下的摄取水平。但细胞活力实验表明，该浓度及更高浓度（最高达100 μg/mL）的BP-PEG在72小时内均未对4T1细胞增殖和存活产生显著影响，说明BP-PEG在生理相关浓度下无直接肿瘤细胞毒性。为验证免疫系统在BP-PEG抗肿瘤过程中的作用，本研究使用免疫缺陷NOD scid gamma（NSG）小鼠构建4T1肿瘤模型，结果显示BP-PEG在该模型中无法抑制肿瘤生长和转移，表明其抗肿瘤活性依赖完整的免疫系统。将人类MDA-MB-231乳腺癌细胞与乳腺癌患者PBMC共培养，发现单独使用BP-PEG或PBMC仅能导致少量肿瘤细胞死亡，而两者联合使用时，超过90%的肿瘤细胞被清除，且PBMC的细胞组成与肿瘤微环境中的免疫细胞分布相似，这一结果进一步证实BP-PEG通过调控免疫微环境发挥抗肿瘤作用。

3. RNA 测序揭示免疫相关通路特异性激活

BALB/c小鼠和NSG小鼠肿瘤组织做bulk RNA测序，结果显示，BP-PEG处理后，两种小鼠模型的肿瘤基因表达谱均发生改变，但NSG小鼠与BALB/c小鼠的DEGs仅重叠17个，而BALB/c小鼠中存在234个特异性差异表达基因。通路富集分析表明，这些特异性DEGs显著富集于免疫相关通路，其中细胞因子-细胞因子受体相互作用通路上调最为明显，与BP-PEG依赖免疫系统发挥作用的结论一致。qPCR验证显示，BP-PEG处理后，IL1A、CXCL2、CCR2等参与肿瘤免疫微环境重塑的基因表达显著上调，这些基因可能通过调控细胞因子分泌和免疫细胞招募，推动肿瘤免疫微环境从免疫抑制向免疫激活转变。

4. 中性粒细胞募集增加并激活效应免疫细胞

为深入解析BP-PEG对肿瘤免疫微环境中免疫细胞群体的影响，作者使用CyTOF对BALB/c小鼠肿瘤组织中的免疫细胞做了全面分析。t-SNE聚类识别出26个不同的细胞亚群，包括中性粒细胞、巨噬细胞、树突状细胞、B细胞、CD8⁺T细胞、CD4⁺T细胞、调节性T细胞（Tregs）和NK细胞等。BP-PEG处理组中性粒细胞亚群（C18）的数量和比例显著增加，占CD45⁺免疫细胞的比例超过20%，成为优势细胞群体；同时，免疫抑制性细胞（Tregs和M2型巨噬细胞）的比例降低，而CD8⁺T细胞和NK细胞中细胞毒性标志物GZMB的表达强度显著上调，表明其抗肿瘤活性增强。免疫组化染色进一步证实，BP-PEG处理后肿瘤组织中Ly6G⁺中性粒细胞数量显著增加，且GZMB⁺阳性细胞比例上升，验证了CyTOF的分析结果，说明BP-PEG通过募集中性粒细胞并激活效应免疫细胞的抗肿瘤功能发挥作用。

5.中性粒细胞核心作用及肿瘤杀伤能力协同增强机制

中性粒细胞耗竭实验进一步证实了其在BP-PEG抗肿瘤中的核心作用。在4T1荷瘤 BALB/c小鼠中，从肿瘤接种后第3天开始每日腹腔注射抗Ly6G抗体以耗竭中性粒细胞，结果显示，单独使用抗Ly6G抗体对肿瘤生长无明显影响，但BP-PEG与抗Ly6G抗体联合使用时，BP-PEG的肿瘤生长抑制作用被显著逆转，肿瘤重量明显增加。免疫组化和流式细胞术验证显示，抗Ly6G抗体处理后肿瘤组织中Ly6G⁺中性粒细胞几乎完全消失，同时GZMB⁺阳性细胞比例显著降低，表明中性粒细胞耗竭导致抗肿瘤免疫应答减弱。单细胞RNA测序和细胞间相互作用分析发现，BP-PEG主要被巨噬细胞吞噬，巨噬细胞摄取BP-PEG后激活炎症信号通路，促使中性粒细胞迁移、脱颗粒调控、先天免疫应答和炎症反应相关基因的表达上调，分泌CXCL2等趋化因子；通过CXCL-CCR信号通路（尤其是CXCL2-CXCR2通路）招募中性粒细胞到肿瘤部位。使用CXCR2抑制剂SB225002处理后，BP-PEG的抗肿瘤效果几乎完全被阻断，证实CXCL2-CXCR2信号通路是BP-PEG介导中性粒细胞募集的关键途径。此外，细胞间相互作用分析显示，BP-PEG处理后中性粒细胞与NK细胞的相互作用数量和强度显著高于与CD8⁺T细胞的相互作用，免疫荧光显示两者在肿瘤组织中空间定位密切；通路富集分析表明，BP-PEG上调了中性粒细胞中先天免疫应答、脱颗粒、氧化应激等抗肿瘤相关通路，增加了具有抗肿瘤表型的T1和T2型中性粒细胞比例，同时增强了NK细胞中颗粒酶介导的程序性细胞死亡通路。共培养实验证实，从BP-PEG处理组肿瘤中分离的中性粒细胞和NK细胞，对GFP标记的4T1细胞的杀伤能力显著高于生理盐水组，而NK细胞耗竭会部分逆转BP-PEG的抗肿瘤效果，表明BP-PEG通过增强中性粒细胞和NK细胞的杀瘤能力，协同发挥抗肿瘤作用。

参考文献：

1. Wang J, Yu W, Shen H, et al (2025) Therapeutic Black Phosphorus Nanosheets Elicit Neutrophil Response for Enhanced Tumor Suppression. Adv Sci (Weinh) 12:e2414779. https://doi.org/10.1002/advs.202414779